免疫共沉淀实验技术（IP）

免疫共沉淀实验技术（IP）

一 免疫共沉淀实验技术

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

二、实验仪器

高速组织捣碎机： SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E）

电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）

电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）

转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）

低温高速离心机：湖南湘仪公司（型号：H2050R）

超低温冰箱：美国FORMA公司（型号：702）

分光光度计：上海分析仪器总厂（型号：721）

脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）

三、主要试剂

HRP标记山羊抗小鼠二抗：北京中山（货号：ZB-2305）

蛋白质预染分子量marker：Fermentas

A蛋白-sepharose珠：Pharmacia Biotech公司产品

NC膜：Millipore公司（型号：0.45um）

化学发光底物底物：PIERCE公司

电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品

其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品

总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所

四、操作流程

1.样品准备:

1）取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF，混匀，超声波破碎细胞

2）4℃，12000rpm离心10min

3）取上清夜，-70℃冻存24hr

5）4℃ 12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。

2.定蛋白及计算电泳上样量:

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug

3.免疫沉淀:

1）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

2）准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物：按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗，4℃孵育1 h，8000rpm离心5 min，PBS洗涤3次，加50ulPBS

3）取100 μg总蛋白，加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物，4℃轻摇2h，PBS洗涤3次，之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃变性3 min，以游离抗原、抗体、珠子，8000 rpm室温离心5 min，蛋白上清储于-20℃备用。

4.电泳:

1）安装好电泳装置

2）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶，灌胶约3/5体积，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)

3）30min后，待凝后倾去封液

4）配5%的浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干

5）上样：各样品取50ug上样，marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)

6）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源，90v电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至150V继续电泳

7）当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳

5.转膜及检测:

1）准备2个12cm的平面皿，一个装去离子水浸泡NC膜20min，另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min

2）取下胶，切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min

3）按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板）

4）完全排除气泡， 4℃，100mA转膜2hr。

5）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min，用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker位置，再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右

6）将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜

7）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗

8）37℃摇床孵育约2hr

9）PBST洗涤4次，每次5min

10）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约30min

11）PBST洗涤4次，每次5min

12）将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好的化学发光底物（A液与B液等体积混和），室温孵育5min后

13）取出NC膜，去尽残液，包好，放入X-光片夹中显影

14）扫描及分析

6.结果：

用Quantity One 4.3.1(Bio-rad)软件对照片进行分析(注意：Trace表示 Band光密度分布曲线下面积)